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微生物組研究通常歸結于兩類問題：誰在那兒以及它們在干什么。為了回答這些問題，生物學家往往使用新一代測序。16S rRNA測序能夠揭示微生物的身份，而轉錄本測序又能夠提供線索，說明這些微生物在干什么。

不過，除了測序，研究人員也利用改造的遺傳工具來研究微生物組。下面，我們就來看看他們如何利用質粒工具來開展微生物組研究。

盡管人們能夠通過測序來監(jiān)控微生物組，但遺傳改造其成員的能力還十分有限，而且許多微生物難以在其天然環(huán)境以外的地方培養(yǎng)。因此，哥倫比亞大學的Harris Wang實驗室開發(fā)了一種原位改造腸道微生物組成員的方法，并發(fā)表在《Nature Methods》雜志上1。

他們將這種方法稱為MAGIC（通過原位接合來改造腸道微生物組）。在MAGIC方法中，研究人員將大腸桿菌供體菌株引入微生物組，從而利用IncPα-family-RP4接合系統(tǒng)將遺傳負荷導入受體。此系統(tǒng)可將質粒引入革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。

研究人員進一步開發(fā)出一套pGT質粒，帶有各種復制起點，適用于各種微生物。它們還含有RP4轉移起點、可選擇的標記以及所需的遺傳負荷（如GFP）。因此，細胞可利用FACS進行分選，并通過抗生素選擇進行分離。

他們在體外和體內測試了該系統(tǒng)。他們在體內實驗中發(fā)現(xiàn)19個屬的細胞通過接合系統(tǒng)攝取了質粒，不過在體外實驗中只鑒定出7個屬，這可能是因為體外條件不能很好地支持有些物種的生長。這些結果也突出了微生物組研究需要原位改造工具。

分析腸道菌群的紙片法

對于臨床和診斷實驗室而言，在處理大量微生物組樣本時，深度測序和qPCR方法都過于昂貴和耗時。為了實現(xiàn)大規(guī)模的腸道微生物組研究，麻省理工學院的James Collins實驗室開發(fā)出一種“紙片法”，可檢測紙上的微生物和生物標志物。這項成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上2。

這種方法的核心在于一種RNA Toehold開關，這是一種RNA發(fā)夾結構，可結合和檢測幾乎任何RNA序列。發(fā)夾的下游是核糖體結合位點（RBS），接著是報告基因。發(fā)夾通過隔離RBS而阻斷翻譯，但“trigger RNA”的結合能夠暴露出RBS，讓報告基因得以翻譯，從而產生GFP信號。通過標準品的使用，這種方法可估算出樣品中mRNA的濃度。

Collins實驗室選擇了10種與疾病相關的細菌，并設計出Toehold開關傳感器（TSS），可對菌種特異的mRNA進行半定量檢測。另外，他們還針對鈣網(wǎng)蛋白和抑癌蛋白M等四種生物標志物開發(fā)出TSS，以分析炎癥性腸病患者的糞便樣本，并用RT-qPCR方法進行驗證。

研究人員還證明，利用此平臺可以檢測艱難梭菌（Clostridium difficile）毒素mRNA的表達。由于mRNA表達無法通過qPCR方法來鑒定，故他們認為這種檢測毒素mRNA轉錄本及其他轉錄本的能力具有潛在價值。

研究蜂類的微生物組

對動物微生物組中存在的細菌進行改造，有望在農業(yè)和醫(yī)學方面取得突破，不過對于蜂類微生物組，目前就缺乏這樣的工具。德克薩斯大學奧斯汀分校的Nancy Moran和Jeffrey Barrick實驗室開發(fā)出Bee Microbiome Toolkit（BTK）來研究大黃蜂和蜜蜂的微生物組3。

這個工具箱含有模塊化的組件，可通過Golden Gate組裝技術組裝在一起，從而快速檢驗新分離細菌的多種抗生素抗性標記、啟動子、熒光報告蛋白及其他編碼序列。

研究人員利用BTK來操控蜜蜂和大黃蜂腸道內固有的變形菌，在一系列變形菌中表達熒光蛋白，讓人們能夠觀察到這些細菌如何在蜂類的腸道內定植。此外，他們還能夠利用BTK來導入CRISPR組分，實現(xiàn)基因功能的破壞或干擾。盡管這些質粒是為蜂類設計的，但它們適合廣泛的宿主，也可用來研究其他動物的微生物組。

對細胞分裂進行計數(shù)

監(jiān)控腸道內微生物群體的動態(tài)，有助于研究人員了解微生物組如何應對感染、失調和抗生素治療。為了促進這方面的研究，哈佛醫(yī)學院的Pamela Silver實驗室開發(fā)出一種合成標記和重新捕獲策略，對細胞分裂進行計數(shù)。這項成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上4。

這種技術稱為分布式細胞分裂計數(shù)（DCDC），它是將熒光蛋白在細胞內組裝成明亮的顆粒。為了實現(xiàn)這一點，實驗室將紅色熒光蛋白（RFP）與自組裝蛋白（SAP）相融合，比如噬菌體衣殼蛋白。這種融合蛋白的表達受到阿拉伯糖誘導型啟動子的控制。

在實驗過程中，首先用阿拉伯糖誘導細胞，讓SAP-RFP融合體開始表達。然后，洗滌細胞，不再產生新的顆粒。在后續(xù)細胞分裂的過程中，含有顆粒的細胞隨時間的變化呈指數(shù)下降，以此確定細胞分裂的次數(shù)。這種方法可用于體內和體外研究。