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細胞培養(yǎng)技術(shù)在生物研究域內(nèi)是必不可少的核心環(huán)節(jié),在培養(yǎng)過程中面臨的一個嚴重問題就是細胞污染,其中支原體是主要的污染源。支原體在光學(xué)顯微鏡下不可見,而且被支原體污染的細胞培養(yǎng)基在一般情況下往往并不渾濁,細胞受損程度也不明顯,形態(tài)很少改變,因此細胞被支原體污染后很難察覺。細胞一旦被支原體污染后,支原體會消耗細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì),代謝產(chǎn)物不斷積累,會導(dǎo)致細胞培養(yǎng)環(huán)境中pH值的改變,誘導(dǎo)或抑制某些細胞因子的表達,會影響培養(yǎng)細胞的代謝和增殖特征。

在日常工作環(huán)境中,支原體可以說無處不在,它可以通過人的毛發(fā)、口腔、穿著的衣服、動物的皮毛以及日常的細胞培養(yǎng)的操作環(huán)境造成對細胞的污染。能夠造成細胞污染的支原體種類有很多,有些細胞甚至同時感染2種以上的支原體。由于支原體體積很小,直徑約在0.2-2.0pm之間,可以通過濾膜而直接造成培養(yǎng)基或血清的污染。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上,支原體形態(tài)多變,多吸附在細胞表面或分散于細胞與細胞之間,是一類沒有細胞壁的微生物,因此對作用于細胞壁類的抗生素(如青霉素)不敏感。

常用的檢測方法有培養(yǎng)法、熒光染色法、PCR法和電鏡觀察法。

培養(yǎng)法是為可靠且成本低廉的方法,但培養(yǎng)周期較長,常用于細胞以及臨床治療細胞的支原體檢査;

熒光染色法是用特異熒光染料(Hoechst 33258)染色后在熒光顯微鏡下進行檢測,熒光染料(Hoechst 33258)是一種能和DNA特異結(jié)合物質(zhì),如果檢測樣品為支原體污染,則附在細胞表面和分散在細胞與細胞之間的支原體DNA著色,在熒光顯微鏡下可見;

PCR法檢測是通過對支原體特定的序列設(shè)計引物,當存在支原體污染時通過PCR特異性擴增,會將目標DNA特異性的復(fù)制,然后通過瓊脂糖電泳觀檢測,會跑出條帶出現(xiàn)陽性結(jié)果,反之當沒有支原體污染時,由于沒有模板,PCR無法擴增,則瓊脂糖電泳跑不出條帶,出現(xiàn)陰性結(jié)果;電鏡觀察法是利用電子顯微鏡的超放大功能,直接觀察培養(yǎng)細胞中支原體污染情況。

在此主要介紹利用熒光染色法來檢測培養(yǎng)細胞中的支原體,具體檢測步驟如下:

(1)細胞爬片培養(yǎng):待測細胞培養(yǎng)至傳代水平,將細胞消化后接種至含有玻片的細胞板中,培養(yǎng)至60%-70%匯合時,進行檢測;

(2)漂洗:將細胞板中的培養(yǎng)液吸出,取出玻片,用PBS輕輕漂洗;

(3)固定:加入適量的固定液,室溫放置10min;

(4)漂洗:用PBS輕輕漂洗3次;

(5)染色:加入適量的熒光染料(Hoechst 33258)工作液,在室溫下放置10min;

(6)漂洗:用PBS輕輕漂洗3次;

(7)鏡下觀察:將玻片晾干后,滴加抗熒光猝滅劑,于熒光顯微鏡下觀察、拍照;